Čas na inovaci

Imunofenotypizace

metoda průtokové cytometrie dostupná pro klienty Veteo

Laboratoř Veteo ve spolupráci s týmem veterinárních onkologů a vědců představuje ve své nabídce imunofenotypizaci buněk metodou průtokové cytometrie.

Zakladatelem a správcem projektu je doktor Dariusz Jagielski.

“Na počátku mé práce s onkologickými pacienty, před téměř dvaceti lety, jsem se zajímal o imunofenotypizaci a průtokovou cytometrii a byl jsem okouzlen potenciálem této metody. Nakonec se nám podařilo shromáždit skupinu lidí, kteří nabízejí cytometrii jako standartní komerčně dostupné vyšetření pro pacienty s rakovinou krevetvorného systému. Základem úspěhu je kontakt s ošetřujícím lékařem – to vede k získání dalších užitečných klinických poznatků z cytometrického vyšetření.”

Náš tým

Náš tým tvoží kvalifikovaní pracovníci pod dohledem zkušené vedoucí, specialistky v oboru veterinární laboratorní diagnostiky – dr n. med. lek. wet. Marta Idziak.

Vedeckou oporu zajištuje dr. Aleksandra Pawlak z Fakulty veterinární medicíny Přírodovědné univerzity ve Vratislavi.

“Průtoková cytometrie je jednou ze základních vědeckých metod, které používám ve své práci. Cytometrická imunofenotypizace psích lymfomů a leukémií byla jednou z částí mé dizertační práce a od té doby jsem skutečným nadšencem této diagnostické metody, stále se rozvíjím v jejím používání. Komercializace vyšetření je podle mě vrcholem mé vědecké práce – protože věda by měla sloužit praxi!”

Zveme ke spolupráci všechny veterinární lékaře se zájmem o veterinární onkologii, kteří chtějí prohloubit hematoonkologickou diagnózu svých pacientů.

Jsme také otevřeni spolupráci s výzkumnými centry.

Průtoková cytometrie

Průtoková cytometrie je metoda široce využívaná v laboratorní diagnostice. Detekcí laserového světla při průchodu buněčné suspenze umožňuje přesné stanovení počtu buněk i jejich morfologických charakteristik. Od počátku naší činnosti používáme nejmodernější veterinární průtokové cytometry dostupné na trhu a nabízíme profesionální analýzy hematologických parametrů u mnoha druhů zvířat.

V současné době jako jediná laboratoř v Polsku kombinujeme technologii průtokové cytometrie s monoklonálními protilátkami a fluorescencí, což nám umožňuje provádět pokročilé imunofenotypizace buněk. Tento přístup umožňuje detekci diferenciačních antigenů (clusters of differentiation, CD) na povrchu i uvnitř buněk a poskytuje přesné určení jejich původu a vlastností.

Indikace k imunofenotypizaci

Imunofenotypizace ve veterinární medicíně se využívá především v hematoonkologii malých zvířat.
V prvních letech naší činnosti bylo toto vyšetření nabízeno výhradně pro psy. Nyní je dostupné také pro kočky.
Naši nabídku jsme navíc rozšířili o vyšetření antigenu Ki-67 u psů – markeru buněčné proliferace, který je užitečný při hodnocení agresivity nádorů.

Hlavní indikace k imunofenotypizaci pomocí průtokové cytometrie u psů a koček zahrnují:

odlišení reaktivních a neoplastických lymfoproliferativních procesů (lymfocytóza / reaktivní lymfatická uzlina vs. leukémie / lymfom)

odlišení akutních a chronických leukémií (poznámka: pouze u psů)

odlišení původu buněk lymfomu (T-lymfocyty vs. B-lymfocyty)

odlišení původu buněk leukémie (lymfoidní vs. myelomonocytární)

hodnocení prognostických parametrů u lymfomu/leukémie (fenotyp, aberace, exprese molekul MHC II)

odlišení nízce a vysoce agresivních lymfomů (Ki-67; poznámka: pouze u psů)

definitivní potvrzení T-zone lymfomu (poznámka: pouze u psů)

odlišení thymomu a mediastinálního lymfomu (poznámka: pouze u psů)

Panel monoklonálních protilátek, které používáme, zahrnuje:

  • u psů protilátky proti všem následujícím markerům
  • u koček pouze protilátky zaměřené na označené markery Cytometrie u koček

CD45 / CD18 Cytometry for cats

marker leukocytů

CD34

marker kmenových buněk

CD3

marker T-lymfocytů (povrchový)

CD3c

marker T-lymfocytů (vnitrobuněčný)

CD4 Cytometry for cats

marker T-lymfocytů pomocníků (helper)

CD8 Cytometry for cats

marker cytotoxických T-lymfocytů

CD5 Cytometry for cats

marker T-lymfocytů

CD21 Cytometry for cats

marker zralých B-lymfocytů (povrchový)

CD79α​

marker B-lymfocytů (vnitrobuněčný)

CD14Cytometry for cats

marker monocytní linie

MHCII

marker hlavního histokompatibilního komplexu třídy II (přítomný na lymfocytech a makrofázích)

CD11​b Cytometry for cats

marker myelomonocytární linie

Ki-67

marker aktivity proliferace buněk

Důležité upozornění

  • Imunofenotypizace buněk pomocí průtokové cytometrie vyžaduje zachování vysoké životaschopnosti buněk. Z tohoto důvodu musí být analýza provedena nejpozději 48–72 hodin po odebrání buněčného materiálu.
  • V případě průtokové cytometrie biopsií lymfatických uzlin a pevných orgánů je nutná příprava buněčné suspenze pomocí speciálního média (viz Pokyny). Tato povinnost se nevztahuje na krev, kostní dřeň nebo tekutiny tělních dutin, které jsou již připravené k analýze.
  • Buněčný materiál nesmí být zmražen ani fixován.
  • Vzorky k průtokové cytometrii jsou přijímány od pondělí do čtvrtka (analýzy se nevykonávají o víkendech ani ve státní svátky).
  • Léky, zejména cytostatika a glukokortikosteroidy, mohou významně ovlivnit výsledky imunofenotypizace. Proto se doporučuje provést analýzu před zahájením léčby.
  • Výsledky imunofenotypizace nelze interpretovat bez znalosti cytopatologických vlastností analyzovaného materiálu a klinických údajů pacienta. Proto je nutné vyplnit online Dotazník a dodat čerstvé vzorky a/nebo výsledky cytologických vyšetření.

Materiál k vyšetření

Pro imunofenotypizaci pomocí průtokové cytometrie lze použít jakýkoli typ tekuté suspenze životaschopných buněk.
Pokud se má analyzovat periferní krev, kostní dřeň nebo tekutina z tělní dutiny, materiál by měl být odebrán do zkumavky s protisrážlivou látkou (jako při kompletním krevním obrazu) a zaslán do laboratoře.
V případě biopsií lymfatických uzlin a jiných pevných orgánů je nutné buňky suspendovat ve speciálním transportním médiu.

Pokyny pro přípravu transportního média pro biopsie lymfatických uzlin/pevných orgánů

  1. Odeberte periferní krev od pacienta podstupujícího biopsii do zkumavky s EDTA.
  2. Odebraný krevní vzorek odstřeďte, abyste získali plazmu.
  3. Smíchejte plazmu se sterilním roztokem NaCl 0,9 % v poměru 1:9. Přibližně 2 ml média stačí pro jeden vzorek pacienta (1,8 ml NaCl 0,9 % + 0,2 ml plazmy).
  4. Vložte buněčný vzorek do připraveného média.

Minimální počet buněk potřebný k provedení analýzy je přibližně 3 miliony životaschopných buněk. Objem vzorku zasílaného k analýze závisí na počtu buněk v testované tkáni a nelze jej přesně stanovit (obvykle stačí 2–3 jádra biopsie lymfatické uzliny, přibližně 2–3 ml periferní krve nebo 1–2 ml kostní dřeně).

Spolu s buněčným materiálem se doporučuje dodat krevní nátěry/cytologické sklíčka a/nebo aktuální výsledky cytologie.

Dotazník pro lékaře objednávajícího vyšetření

Dotazník pro vyšetření

Zajímavé případy

Níže uvádíme krátké kazuistiky, které demonstují diagnostický potenciál imunofenotypového testování buněk psů průtokovou cytometrií.

Knírač s klinickým podezřením na lymfom

  • 10letý knírač s klinickým podezřením na lymfom potvrzeným cytopatologickým vyšetřením lymfatických uzlin.
  • Aby bylo možné posoudit klonalitu a původ neoplastických buněk, byl proveden test PARR, který překvapivě přinesl negativní výsledek (byly nalezeny znaky polyklonální proliferace z T a B lymfocytů jako při nenádorové stimulaci lymfatických uzlin).
  • Výsledky cytometrické analýzy ukázaly, že dominantní populací ve vyšetřované mízní uzlině byly středně velké až velké buňky s imunofenotypem CD45+ CD21+ CD79α+ MHC II+. Tento výsledek indikoval narušení fyziologických proporcí mezi T a B lymfocyty v mízní uzlině a jasně naznačoval nadměrnou proliferaci B lymfocytů*.

S přihlédnutím ke klinickým údajům a výsledkům cytologie lymfatických uzlin u pacienta umožnila imunofenotypizace rozptýlit pochybnosti o konečné diagnóze – byla nalezena přítomnost B-buněčného lymfomu a byla zahájena vhodná terapie.

*Pawlak A, et al. Immunophenotypic characterization of canine malignant lymphoma: a retrospective study of cases diagnosed in Poland Lower Silesia, over the period 2011–2013. Veterinary and Comparative Oncology, 2014, 14, 52–59.

 

Shih-tzu s příznaky generalizované lymfadenopatie a výraznou lymfocytózou v periferní krvi

  • 11letá fena shih-tzu s příznaky generalizované lymfadenopatie a výraznou lymfocytózou v periferní krvi přetrvávající asi rok
  • Histopatologické vyšetření extirpované submandibulární mízní uzliny provedené na začátku diagnostického procesu naznačilo její reaktivní hyperplazii, která nekorelovala s klinickým obrazem.
  • Výsledek imunofenotypizace indikoval ve vyšetřované uzlině přítomnost jasně dominantní populace buněk s imunofenotypem CD45- CD3+ CD8+ CD5+ MHC II+. Přítomnost velké populace buněk s fenotypem cytotoxických T lymfocytů bez exprese lymfocytárního markeru (CD45) svědčila o jejich neoplastické transformaci.

V tomto případě umožnila imunofenotypizace potvrdit přítomnost klinicky významného lymfomu a podle údajů z literatury navrhnout jeho podtyp jako lymfom T zóny (TZL).*

*Seelig DM, Avery P, et al. Canine T-zone lymphoma: unique immunophenotypic features, outcome, and population characteristics. J Vet Intern Med 2014; 28: 878-86.

 

Boxer s generalizovanou lymfadenopatií a cytologickým podezřením na lymfoblastický lymfom

  • 7letý boxer s generalizovanou lymfadenopatií a cytologickým podezřením na lymfoblastický lymfom
  • Cytometrická analýza umožnila identifikaci jasně dominatní populace buněk ve vyšetřovaných mízních uzlinách s fenotypem CD45+ CD3+ CD5+ CD4+, což odpovídá pomocným T lymfocytům. Díky imunofenotypizaci byla přítomnost lymfomu rychle a jednoznačně potvrzena, navíc byl jeho původ stanoven na T buňky. Podle literatury může fenotyp CD45+ CD4+ u lymfomů T buněk předvídat agresivní povahu a rychlou progresi rakovinného onemocnění* a boxeři jsou považováni za plemeno s vysokou predispozicí k tomuto typu neoplazie**.

 

*Avery PR, Burton JL, et al. Flow cytometric characterization and clinical outcome of CD4+ T-Cell Lymphoma in dogs: 67 cases. J Vet Intern Med 2014; 28: 538-546.
**Lurie DM, Milner RJ, et al. Immunophenotypic ad cytomorphologic subclassification of T-cell lymphoma in the boxer breed. Vet Immunology and Immunopathology 2008; 125: 102-110.

 

Kříženec v těžkém celkovém stavu se silnou leukocytózou a přítomností atypických buněk v nátěru periferní krve

  • 9letý kříženec v těžkém celkovém stavu se silnou leukocytózou, anémií, trombocytopenií a přítomností atypických buněk v nátěru periferní krve
  • V důsledku krevní cytometrické analýzy byla zaznamenána jasně dominatní populace kmenových buněk (CD34+) se současnou expresí markeru B lymfocytů (CD79α+).
    Fenotypované buňky neexpirmovaly markery CD14 a CD4, což umožnilo s vysokou pravděpodobností vyloučení linie myelomonocytární hyperplazie. V tomto případě byla imunofenotypizace základem pro konečnou diagnózu akutní lymfoblastické leukémie typu B (ALL-B)*.

 

* Vernau W, Moore PF. An immunophenotypic study of canine leukemias and preliminary assessment of clonality by polymerase chain reaction. Vet Immunol Immunopathol 1999; 69: 145-164.

 

Miniaturní knírač nevykazující žádné klinické příznaky s výraznou lymfocytózou přetrvávající několik měsíců

  • 15letý miniaturní knírač nevykazující žádné klinické příznaky s výraznou lymfocytózou přetrvávající několik měsíců bez přítomnosti atypických buněk v periferní krvi
  • V cytometrické analýze krve dominovala populace buněk s fenotypem CD45+ CD21+ CD79α+ MHC II+, což odpovídá lymfocytům B. Současně nedostatek exprese markeru kmenových buněk (CD34) vyšetřovaných buněk vyloučil přítomnost akutní lymfoblastické leukémie. Výsledek testu imunofenotypizace v tomto případě (v kontextu klinických údajů a výsledku nátěru periferní krve) umožnil zvážit přítomnost chronické lymfocytární leukémie B buněk (CLL-B) nebo případně lymfom malých B buněk (SLL-B) s postižením krve*.

*Comazzi S, Gelain ME, Martini V. Immunophenotype Predicts Survival Time in Dogs with Chronic Lymphocytic Leukemia. JVIM 2011: 25; 100-106.

 

Kočka s chronickou lymfocytózou nejasného původu

  • 12letá kočka s lymfocytózou přetrvávající déle než 2 měsíce a s mírně atypickými znaky lymfocytů pozorovanými při mikroskopickém vyšetření krevního nátěru
  • Průtoková cytometrická analýza krevního vzorku pacienta umožnila identifikovat jasně dominantní subpopulaci lymfocytů s fenotypem CD18+CD5+CD4+, odpovídajícím T-lymfocytům pomocníkům. Podle literatury* je takový výsledek imunofenotypizace silně sugestivní pro neoplastický proces lymfoidní linie (leukémie nebo lymfom v leukemickém stádiu).

*Rout E.D., et al. Immunophenotypic characterization and clinical outcome in cats with lymphocytosis. Journal of veterinary internal medicine 2020; 34: 105-116.